Аскорбиновая кислота и глюкоза в коррекции процессов свободнорадикального окисления (экспериментальное исследование. Часть I).

Тимен Л.Я., Шерцингер А.Г., Чичук Т.В., Варданян Э.С., Трубицына И.Е., Чикунова Б.З., Жигалова С.Б., Мусин Р.А., Ильина С.Е., Ольховский П.А., Стоногин С.В.,

Городская клиническая больница №20, Российский научный центр хирургии РАМН, кафедры биофизики и медицинской и биологической физики РГМУ,

ЦНИИ гастроэнтерологии, Москва.

Принятые сокращения:

АТР-аденозинтрифосфат.

В настоящее время свободнорадикальным реакциям, определяющим сущность «свободнорадикальных патологий», принадлежит одна из ведущих ролей в патогенезе различных заболеваний, в том числе и язвенной болезни [1,2,3,4]. Генерация активных форм кислорода, связанная с продолжительной тканевой гипоксией, препятствует заживлению язв, формированию полноценного рубца и создает прецедент для хронизации воспалительно-деструктивных изменений тканей [5]. На основании изучения патоморфологии тяжелой кровопотери и геморрагического шока при язвенных гастродуоденальных кровотечениях Л.Я. Тименым и соавт. [6] разработана концепция метаболической реабилитации, в соответствии с которой у шоковых пациентов в связи с энергетической недостаточностью с целью восстановления местного гомеостаза выполняется эндоскопический превентивный метаболический гемостаз с использованием 5% растворов глюкозы и аскорбата. Высокий противорецидивный и репаративный эффект этих препаратов, прошедших успешную экспериментальную проверку, был подтвержден и при лечении пищеводных кровотечений, а также осложнений, связанных с лигированием либо склерозированием варикозно-расширенных вен у больных с портальной гипертензией [7]. Но какова при этом динамика свободнорадикальных реакций? Существует ли необходимость коррекции свободнорадикального статуса? Эти вопросы и определили цель настоящего исследования – выяснить результаты воздействия аскорбата и глюкозы на механиз-мы свободнорадикального окисления.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучен свободнорадикальный статус крыс в процессе заживления экспериментальных ран при местном инъекционном лечении 5% растворами глюкозы и аскорбата. Исследования выполнены в трех группах беспородных крыс средним весом 300-350г: контрольной (8 крыс) и двух опытных (по 6 крыс), где применили инъекционные методики. Модельные раны (метод Л.И.Слуцкого), размером ≈ 3,0 см2, создавали в области холки животных под эфирным наркозом. На рану «одевалось» тефлоновое кольцо диаметром 2,0 см. Кольцо закрывалось полиэтиленовой пленкой, обработанной этиловым спиртом и фиксированной проволокой к основанию кольца (рис.1)

Рис.1

Экспериментальная модель раны.

В опытных группах крыс под раневую поверхность двукратно, с интервалом 48 часов, внутримышечно вводилось по 10мл 5% раствора глюкозы или аскорбата. Раневой экссудат собирали через 2, 3 и 4 суток после операции. Затем снимали кольца и наблюдали динамику заживления ран. Для оценки свободнорадикального статуса изучены изменения антиоксидантной способности раневого экссудата (активности супероксиддисмутазы, интенсивности и латентного периода кумарин-зависимой хемилюминесценция раневого экссудата в присутствии железа), а также функциональной активности лейкоцитов экссудата. Измерение активности супероксиддисмутазы выполнено в модификации Г.И. Клебанова и соавт., оценка кумарин-зависимой хемилюминесценции произведена в соответствии с модифицированной методикой Ю. А. Владимирова и соавт. Лейкоциты выделяли по методу А.Boyum, а их функциональная активность определена методом люминол-зависимой хемилюминесценции. С целью получения более объективной оценки результатов исследования регистрация всех показателей свободнорадикального статуса крыс производилась одновременно у каждого животного.

Заживление ран и язвенных дефектов в настоящее время можно рассматривать как сложный скоординированный стадийный процесс, протекающий в соответствии с особенностями адаптивной репарации. Несмотря на существенные различия в этиологии и патогенезе, течение ран и язвенной болезни объединяет общий стереотип, обусловленный одними молекулярно-клеточными механизмами деструктивных изменений и неспецифической реакцией клеток на повреждение [8]. Кроме того, продолжительность фазы репарации ран и гастродуоденальных язв в значительной степени зависит от активности свободнорадикальных реакций в зоне пораженного субстрата [1,5,9]. Сходство биологических процессов, отражающих закономерности заживления ран и язвенных дефектов, позволило нам избрать экспериментальную модель ран для изучения биофизических механизмов влияния глюкозы и аскорбата на активность свободнорадикального окисления.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты выполненных исследований продемонстрировали анти- и прооксидантный эффект ингредиентов эндоскопического превентивного метаболического гемостаза, более выраженный у аскорбата. Оценка антиоксидантной защиты произведена на основании изменений активности супероксиддисмутазы, а также интенсивности и латентного периода кумарин-зависимой хемилюминесценции раневого экссудата. Фермент супероксиддисмутаза является сильнейшим антиоксидантом, поскольку в его присутствии скорость дисмутации 0₂. увеличивается почти в миллион раз. Латентный период кумарин-зависимой хемилюминесценции отражает степень ингибирования свободнорадикальных реакций эндогенными антиоксидантами раневого экссудата. По интенсивности кумарин-зависимой хемилюминесценции можно судить о степени окисления и количестве липидов в субстрате. Низкие показатели интенсивности кумарин-зависимой хемилюминесценции и большой латентный период характеризуют высокое качество собственной эндогенной системы антиоксидантной защиты. Функциональная активность лейкоцитов – индикатор продукции прооксидантов, а также инициации иммунной системы, фагоцитоза, пролиферации и ангиогенеза [10]. При изучении антиоксидантной активности раневого экссудата (рис.2,3) установлена ведущая роль аскорбата в формировании мощной комбинированной антиоксидантной защиты. Так, инъекции аскорбата к 4 суткам после операции приводили к нарастанию активности супероксиддисмутазы (рис.2) и снижению уровня окисления липидов в раневом экссудате (рис.3а). Последнее, вероятно, было связано с активацией системы эндогенных антиоксидантов, т.к. латентный период кумарин-зависимой хеми-люминесценции к 4-м суткам постепенно возрастал (рис.3б). Инъекции глюкозы не вызывали эффекта активации супероксиддисмутазы (рис.2), но оказывали антиоксидантное воздействие с умеренным снижением окисления экссудата (рис.3а).

Рис.2 Изменение супероксиддисмутазной активности раневого экссудата

А₀ – СОД активность на 2 сутки

А - СОД активность на 3-4 сутки

Рис.3а Изменение интенсивности собственной  хемилюминесценции раневого экссудата

I₀ - интенсивность свечения на 2 сутки

 I - интенсивность свечения на 3-4 сутки

Рис. 3б. Изменение латентного периода собственной хемилюминесценции раневого экссудата.

Т₀ – латентный период на 2 сутки,

Т – латентный период на 3 -или 4 сутки.

Рис.4 Изменение функциональной актив-ности лейкоцитов раневого экссудата.

I_О - интенсивность свечения на 2 сутки ,

I - интенсивность свечения на 3-4 сутки.

Повышение функциональной активности лейкоцитов при введении глюкозы и аскорбата, отмеченное на основании увеличения продукции лейкоцитами О2. (рис.4), свидетельствовало о возрастании прооксидантного компонента свободнорадикального статуса, с помощью которого становится возможным восстановление физического и биохимического равновесия в тканях и реализация репаративной фазы воспаления. Кроме того, нарастание активности самих клеток лейкоцитарного звена указывало на интенсификацию процессов заживления.

Свободнорадикальные реакции представляют один из механизмов фазы репарации, поскольку участвуют в формировании клеточного иммунитета, способствуют выживаемости клеток в неблагоприятных ситуациях и ускоряют заживление ран [9]. Антиоксидантная и прооксидантная системы, подвижные константы свободнорадикального статуса, находятся в состоянии динамического равновесия и по-своему отражают проявление биосоциального закона единства и борьбы противоположностей. Собственный опыт использования инъекционной формы эмоксипина, одного из лидеров современных антиоксидантов, для эндоскопического лечения различных вариантов язвенной болезни не подтвердил существующую точку зрения о превалирующей роли факторов свободнорадикального окисления в патогенезе язвенной болезни и патогенети-ческом обосновании назначения антиоксидантов (эмоксипина) в терапии язвенной болезни [4]. По-видимому, установленный нами высокий метаболический эффект 5% раствора аскорбата в составе эндоскопического превентивного метаболического гемостаза был обусловлен анти- и прооксидантными свойствами (рис.2,3,4), а также иными механизмами репаративного воздействия аскорбата. Заслуживают внимания наблюдения, свидетельствующие о том, что пиковые показатели результатов влияния аскорбата на обменные [6] и биофизические процессы фиксировались к 3-4 суткам с момента введения. Этот факт является дополнительным подтверждением необходимости продолжительного использования аскорбата в лечении язвенных гастродуоденальных кровотечений, осложненных тяжелой кровопотерей и геморрагическим шоком. Известно, что при гиповолемии в случае восстановления системного, а также местного кровотока (≈ 3-4 сутки) концентрация потребляемого кислорода резко возрастает. Распад белковых структур и формирование конечных продуктов обмена пуриновых производных на фоне наступающего «кислородного (дыхательного) взрыва» при реперфузии протекают с образованием больших концентраций перекисей и супероксидных радикалов кислорода. В подобных ситуациях аскорбат выступает в роли «кислородной ловушки» [9.11]. При этом антирадикальное ингибирование осуществляется системой «глутатион-аскорбат-токоферол», транспортирующей электроны (в составе ионов водорода) от пиридиннуклеотидов к кислородным радикалам:

Участие аскорбата в регенерации токоферола обеспечивает формирование сдвоенной системы антиоксидантной защиты [11). В то же время аскорбат направляет «кислородный взрыв» и в полезное для организма русло. Интенсивное поглощение нейтрофилами витамина С сопровождается биосинтезом бактерицидных свободнорадикальных субстанций, уничтожающих предраковые клетки, бактериальные, вирусные и другие чужеродные агенты [12].Следовательно, присутствие аскорбата в тканях с признаками воспаления, деструкции и ишемии является патогенетически обоснованным и необходимым. Следует отметить особое значение аскорбата в регуляции дыхательной функции клеток. Освобождение от кислородных радикалов, а затем и от метаболитов свободнорадикального окисления, повреждающих органеллы, позволяет оптимизировать доставку кислорода в клетки. Но для восстановления кислорода в митохондриях требуется бесперебойный транспорт электронов и дополнительная энергия, к выработке которой аскорбат имеет непосредственное отношение, поскольку является донато-ром и переносчиком Н+ ионов (мощных энергоносителей) к внутренней сопрягающей мембране митохондрий. Транзит электронов по дыхательной цепи митохондрий, цитохромоксидаза, трансмембранный электрохимический потенциал ионов водорода формируют энергию, достаточную для синтеза АТР на конечном этапе окислительного фосфорилирования [13,14]. Восстановление молекулярного кислорода предполагает и регенерацию с помощью аскорбата кофермента Q (убихинона), переносчика электронов в дыхательном цикле митохондрий [10,11]. С нашей точки зрения значительное возрастание функциональной активности лейкоцитов при введении аскорбата (рис.4) косвенным образом свидетельствовало о реализации факторов защиты, улучшении дыхательной функции и, значит, жизненного потенциала не только лейкоцитов, но и других клеток организма. Как видно, мобильность Н⁺ ионов приобретает при гипоксии чрезвычайно важную роль. И поэтому у критических пациентов с язвенными гастродуоденальными кровотечениями, испытывающих тяжелейшую гипоксию, применение блокаторов водородной помпы в связи с депрессией ионов водорода не представляется целесообразным, согласно хемиосмотической теории окислительного фосфорилирования P. Mitchell [13,14],

Установленное в эксперименте умеренное влияние глюкозы на течение свободнорадикальных реакций не является ведущей функцией глюкозы в системе жизнеобеспечения организма. Известно, что основная роль глюкозы при тяжелых и критических состояниях - восстановление физиологического и структурного метаболизма, энергетического обмена, клеточного дыхания и нивелирование тем самым субстрата, благоприятного для свободнорадикального окисления [13]. В нашем исследовании (рис.4) постоянная функциональная активность лейкоцитов на протяжении недели (с повышением на 3 сутки) при введении глюкозы, по-видимому, отражала суть закономерности всех механизмов заживления – нормализацию дыхательной функции клеток поврежденного субстрата. В аналогичные сроки при клинико-морфологическом и экспериментальном изучении лечебного эффекта глюкозы [6] мы отметили стойкое (до 4 суток) накопление полиаминосахаридов в эпителиальных клетках, строме желудка, просвете желез и сформированной уже на 3 сутки грануляционной ткани (рис5).

Рис.5. Зрелая грануляционная ткань с множественными глыбками полиаминосахаридов PAS-реакция х 200

Очевидно, 3-4 сутки представляют начало эффективного периода реализации метаболической активности глюкозы и аскорбата. Энергия АТР, синтезированного в ходе гликолиза и фосфорилирования (т.е. при участии глюкозы и аскорбата), необходима для осуществления внутриклеточных реакций. Разобщение этих процессов пагубно для организма, а сопряжение достигается в случае их непрерывной «подпитки» в соответствии с законом К. Бернара о постоянстве внутренней среды. Только тогда происходит аккумуляция освобождающейся энергии в биологических резервуарах [6,15] и восстановление функций митохондрий, блокированных метаболитами свободнорадикального окисления [16]. Поэтому применяемый нами эндоскопический превентивный метаболический гемостаз выполняется в качестве продолженного в течение 6 суток с целью потенцирования и стабилизации местного гомеостаза [15]. Объединенный лечебный эффект ингредиентов эндоскопического превентивного метаболического гемостаза позволяет преодолеть катаболический барьер при геморрагическом шоке и уже на 3-4 сутки достигнуть формирования в язвенном дефекте неполноценных коллагено-вых волокон и признаков начальной эпителизации (рис.6)

Рис.6 Язва желудка. Начало рубцевания. Незрелые коллагеновые волокна ван Гизон х 200

По-видимому, механизмы заживления, инициированные введением аскорбата и глюкозы, носят универсальный характер. Так, выполнение метаболической коррекции при тяжелейших воспалительно-деструктивных поражениях пищевода в связи с эндоскопическим склерозированием или лигированием варикозных вен приводило к значительному уменьшению воспалительной инфильтрации тканей в «стандартные» сроки (4-5сутки) и появлению ранних признаков рубцевания дефектов на 10 сутки.

Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали существенные нарушения свободнорадикального статуса в динамике течения раневого процесса при экспериментальном воспроизведении ран. Можно полагать, что аскорбат является одним из ведущих факторов, формирующих физиологический свободнорадикальный статус. Биофизические механизмы репаративного воздействия этого вещества, очевидно, обусловлены анти- и прооксидантной направленностью функций 5% раствора аскорбата. Но для реализации этих и других функций аскорбата у больных с метаболической недостаточностью необходим достаточный энергетический фон, который создается в случае постоянного поступления в организм субстратов энергообеспечения, одним из которых является глюкоза [13]. В связи с этим только совместное использование глюкозы и аскорбата имеет, по нашему мнению, достаточное патогенетическое обоснование и позволяет выполнить успешную местную метаболическую реа-билитацию у пациентов с различными типами воспалительно-деструктивных повреждений, обусловленных язвенными гастродуоденальными кровотечениями и последствиями эндоскопического лечения варикозно-расширенных вен пищевода при портальной гипертензии.

Литература

1. Hart J. Inflammation p.I : Its role in the healing of acute wounds J. Wound Care 2002.11(6): P. 205-209
2. Голиков А.П., Бойцов С.А., Михин В.П., Полумисков В.Ю. Свободнорадикальное окисление и сердечно-сосудистая патология, коррекция антиоксидантами. Лечащий врач, 2003. №4, С.70-74
3. Васильев А.П., Стрельцова Ю.Н., Сенаторов Ю.Н. Кардиометаболическая терапия ИБС Клиническая медицина, 2004, №4 С.59-62
4. Мосина Л.М., Власов А.П. Влияние эмоксипина на свободнорадикальное окисление при экспериментальной язве Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 2004,№ 1 С.47-48
5. Потапова В.Б., Гудкова Р.Б., Соколова Г.Н. Особенности соединительной ткани слизистой оболочки желудка при длительно не рубцующейся язве Экспер. и клин. гастроэнтерология, 2004,№4 С.24- 26
6. Тимен Л.Я., Трубицына И.Е., Чикунова Б.З., Шерцингер А.Г. и др. Эндоскопический превентивный метаболический гемо-и гомеостаз в лечении язвенных гастродуоденальных кровотечений, осложненных тяжелой кровопотерей и геморрагическим шоком Экспер. и клин. гастроэнтерология 2004, № 3 С. 50-53
7. Шерцингер А.Г., Жигалова С.Б., Маргиани З.Ш. Анализ осложнений при выполнении эндоскопического лигирования варикозных вен пищевода 9-й Моск. Межд . Конгресс по эндоскопической хирургии. Москва, 6-8 апреля 2005. С.447-448
8. Насонов Д.Н. Местная реакция протоплазмы и распространяющееся возбуждение. 2изд. М.-Л, 1962
9. Толстых П.И., Клебанов Г.И., Шехтер А.Б., Толстых М.П., Тепляшин А.С. Антиоксиданты и лазерное излучение в терапии ран и трофических язв. Изд.дом «Эко» 2002. Москва
10. Березов Т.Т., Коровин Б.Ф. Биохимия 2002. М.Медицина
11. Илларионов М.Ю. Биохимические процессы, лежащие в основе свободноради-каль-ного окисления, механизмы антирадикальной защиты, оценка их эффективности у онкологических больных. http: // www. Medlinks.ru 08.02.2005
12. Moser R., Weber F. Uptake of ascorbinic acid by human granulocytes // Int. Archs. Allergy Appl. Immun.- 1986.- 81-P.46
13. Murray R., Granner D., Mayes P., Rodwell V. НARPER,S BIOCHEMISTRY. APPLETON & LANGE San Mateo, California 1988. Vol.1,2
14. Черешнев В.А.,Юшков Б.Г. Патофизиология. Москва “ Вече” 2001
15. Тимен Л.Я., Шерцингер А.Г., Жигалова С.Б., Васильева А.А., Сидоренко Т.П. Эндоскопический гемо-и гомеостаз –патогенетическое направление в лечении язвен-ных гастродуоденальных кровотечений, осложненных тяжелой кровопотерей и геморрагическим шоком / 8-й Моск. Межд. Конгр. по эндоскопической хирургии. Москва 21-23 апреля 2004. С.347-348
16. Усенко Л.В., Шифрин Г.А. Интенсивная терапия при кровотечениях КиIв. «Здо-ров,я» 1995

Данные об авторах:

1. Тимен Леонид Яковлевич – подполковник медицинской службы, член Американ-ской академии медицинских наук, член американской академии наук, врач-эндоскопист высшей категории 20-й городской клинической больницы г. Москвы раб. Тел. 471-33-62. 129327 Москва, Ленская 15, 3-й корпус, отделение эндоскопии.
2. Шерцингер Александр Георгиевич – доктор медицинских наук, руководитель отдела экстренной хирургии Научного центра хирургии Российской академии медицинских наук. 129327 Москва, Ленская 15, 5-й корпус, 3-е хирургическое отделение.
3. Жигалова Светлана Борисовна – ассистент кафедры хирургических болезней N2 Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова на базе городской клинической больницы N20 г. Москвы, кандидат медицинских наук. Раб. Тел. 471-08-98. 129327 Москва, Ленская 15, 5-й корпус, 3-е хирургическое отделение.
4. Стоногин Сергей Васильевич – хирург инфекционного корпуса Тушинской детской городской больницы г. Москвы, кандидат медицинских наук. 143406 Красногорск, Железнодорожная 28А 24. E-mail: svas@vpost.ru